Linea di controllo
Immunizing una serie animale con il anticorpo (s) da una diversa specie in grado di generare anticorpi secondario. Per esempio, l'iniezione di mouse anticorpi in un animale diverso da una mouse sollevare anti-topo anticorpi secondario. Capra, asino, e di coniglio sono il più comunemente usato host specie per la produzione di anticorpi secondario.
I tipi più comuni di anticorpi sono quelli generati secondario contro un pool di popolazione di immunoglobulins da un bersaglio specie.
Per esempio, immunizing una capra con purificata mouse IgG genererà capra anti-topo IgG anticorpi che si legano a tutti i classi, catene pesanti e leggeri (HL) e frammenti di mouse IgG, così come qualsiasi altro molecole di condividendo la rigorosamente conservati domini (e.g., igM condividono la stessa kappa catene leggere come IgG).
In contrasto, immunizing una capra con solo il mouse IgG1 anticorpi sarà generare anticorpi specifici per il mouse IgG1 anticorpi e le molecole di condividere il rigorosamente conservati i domini.
A causa della elevata grado di conservazione in la struttura di molti immunoglobulina domini, classe-specifici anticorpi secondario deve essere affinità purificata e cross-adsorbito per ottenere minimo cross-reazione con altri immunoglobulins.
Immobilizzato mouse IgG1 anticorpi in grado di purificare tutti i capra anticorpi che si legano a mouse IgG1 utilizzando il di cui sopra esempio. Il passaggio attraverso un cromatografia su colonna (s) contenente mouse IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM, ecc, sarebbe ulteriormente affinare queste anti-topo IgG1 anticorpi per rimuovere eventuali cross-reagire anticorpi con non-IgG1 isotypes.
Inoltre, il passaggio attraverso colonne contenente immobilizzato siero proteine da specie diversi da quelli utilizzati per immunize l'host può ulteriormente purificare anticorpi secondario. Questo metodo di adsorbimento (spesso indicato come "Altamente cross-Adsorbito") È un ulteriore purificazione passo raccomandato per applicazioni quando si utilizza primaria anticorpi da più specie e quando immunoglobulins o altri siero proteine possono essere presenti in i campioni sondato.
I Prodotti della Linea di controllo
| Anticorpo | Applicazione |
| Coniglio IgG | Per immunodiagnostic: ELISA, LFA, CLIA |
| Mouse IgG | |
| Mouse IgM | |
| Pollo IgY | |
| Capra Anti Mouse IgG | |
| Capra Anti Coniglio IgG | |
| Capra Anti Pollo IgY | |
| Mouse Anti IgG Umani |
Isotype di Controllo
Lo scopo primario del isotype di controllo è quello di determinare che il legame del anticorpo primario è specifico, piuttosto che non-specifico Fc recettori o le interazioni con altre proteine. Si può anche bind anticorpi competitivo ed eseguire la stessa funzione come funzione-blocco anticorpi.
Il isotype di controllo dovrebbe essere del tutto coerente con la fonte del anticorpo primario, Ig la digitazione, E l'etichettatura.
UN normale siero può essere usato come un controllo negativo in immunofluorescence etichettatura se il anticorpo primario è polyclonal. A causa delle diverse fonti di fluorescently etichettato mAbs, senza etichetta mAbs dalla stessa fonte dovrebbe essere utilizzato come isotype controlli per regolare colorazione di fondo. Per esempio: Per esempio, se il anticorpo primario è mouse anti-rat CD11b e clone OX-42 purificata IgG, la sua isotype è mouse IgG2a, in modo da purificata mouse IgG2a può essere utilizzato come il isotype di controllo o OX-42.
Isotype di controllo: si riferisce allo stesso immunoglobulina subclass come Moab in unimmunized mouse, fattori come ad esempio cellulare autofluorescence, FC receptor-mediata anticorpo vincolante, E non-specifico anticorpo vincolante sono stati principalmente considerato. Se diretta immunofluorescence colorazione è utilizzato, il isotype di controllo dovrebbe anche essere etichettati con pigmenti fluorescenti, ad esempio come IgG1 FITC, IgG2a, PE, ecc. In aggiunta, il isotype di controllo e Moab-etichettato fluorochrome concentrazione e F:P ratio (il rapporto di etichettati fluorochrome per le molecole di immunoglobulina) dovrebbe essere la stessa come il migliore, Che è di vitale importanza per un accurato impostazione di negativo e positivo delle cellule di punti di riferimento Significato. Non utilizzare un isotype di controllo che non corrisponde MoAb, preferibilmente un prodotto preparato dallo stesso laboratorio e utilizzando lo stesso processo o metodo (come ad esempio lo stesso marca).
Isotype Citometria a flusso di Controllo
La Fab superficie frammento del anticorpo può legarsi al cellulare con bassa affinità e non-specificità, soprattutto quando il cellulare è morto o la membrana cellulare è danneggiato; questo non-specifico vincolante sarà più evidente. Quindi, controlli isotype sono spesso utilizzati in esperimenti per determinare i livelli di sfondo di fluorescenza.
Il isotype di controllo utilizzato per essere un classico negativo di riferimento in citometria a flusso. Per ottenere la stessa cross-reattività tra il isotype di controllo e il anticorpo, il isotype, specie, fluoresceina, fluoresceina, rapporto di proteine, la concentrazione, e altri indicatori deve essere coerente.
Precauzioni:
1. Se il antigene espressione è una distribuzione bimodale, e il negativo e il positivo picchi sono separati, I risultati sperimentali può capire attraverso la distribuzione bimodale.
2. Se il coltivate le cellule hanno bisogno di essere rilevato, quindi impostando il isotype di controllo in questo momento può solo ottenere alcune informazioni che riflette la capacità di adesione delle cellule, ed è difficile da ottenere informazioni che riflette la sua non-specifico di fluorescenza. Quindi, la creazione di una isotype di controllo per rilevare le cellule coltivate non è l'ideale.
3. Se una varietà di fluoresceina è utilizzato in l'esperimento, allo stesso tempo, durante le analisi, si è constatato che la fluorescenza di dispersione ha un impatto significativo sul risultati, E lo sfondo di fluorescenza non è evidente, non è adatto per impostare il controllo isotype in questo momento. Buona scelta. (FMO controlli sono le cellule di la stessa specie, macchiato con tutti gli altri fluoresceins con un fluoresceina rimosso in modo che la perdita dei vari fluoresceins per il senza etichetta canale può essere si manifesta e il cancello può essere collocato in luogo, così, è una condizione necessaria per il controllo gating. E il controllo FMO è solo significativo quando è essenziale per distinguere tra positivo e negativo con precisione. Esperimenti di controllo è ora comunemente usato in multicolor FMO ed è necessario per multicolore esperimenti.)
4. Quando si utilizza il isotype di controllo, si è constatato che il non-specifico vincolante livello è molto alta, che può essere a causa di il legame del non-specifico Fc end per il cellulare, risultante in un non-segnale specifico, in modo da prestare attenzione a Fc blocco.
5. È necessario comprendere che il isotype di controllo è solo un punto di riferimento per aiutarci a filtrare alcuni fattori che influenzano il esperimento, ma non possiamo determinare il positivo e negativo di taglio punti o impostare un cancello sulla base di questo. Dobbiamo sapere che il isotype di controllo in grado di riflettere solo lo sfondo di fluorescenza di non-specifico vincolante, E lo sfondo di fluorescenza è ha anche causato da altri fattori, come ad esempio autofluorescence, di alta compensazione, anticorpi, etichettatura metodi, strumenti, altri reagenti o di analisi dei dati, e di altri fattori influenzerà lo sfondo di fluorescenza.
6. È necessario per titrate il bersaglio degli anticorpi per ridurre lo sfondo di fluorescenza di non-specifico vincolante, E non è adatto per impostare un isotype di controllo. A causa della eccessiva quantità di anticorpi, negativo maiusc peak e base di ampliamento si verificherà.
7. Se di segnalazione cellulare e citochine vengono rilevati in l'esperimento, il FMO di controllo e il negativo controllo biologico deve essere impostato, prestando particolare attenzione a unstimulated celle o le cellule trattati con phosphorylation inibitori.
8. La vitalità cellulare colorante è aggiunto per il multicolor schema per rimuovere le cellule morte. Perché il non-specifico colorazione delle cellule ucciso è estrema, se non rimosso, si arriverà ad una maggiore non-specifico vincolante e influenzare la esperimento.
9. It s 'a disposizione per impostare gli altri controlli inoltre il isotype di controllo in diverse situazioni. Per esempio, per le cellule di unstained, determinare i controlli negativi per lo sfondo e autofluorescence, impostare la PMT di tensione;
Per le cellule completamente macchiato, determinare alcuni fuori asse eventi, impostare la PMT di tensione; per singolo-macchiato le cellule/microsfere, regolare di compensazione; unstimulated O non trattati campioni, sperimentale di controllo negativo; le cellule positive (stimolato o trattati con particolare farmaci), positivo pratico di controllo.
